脓毒症的异质性：新的生物学证据及其临床应用

引文

   自30年前第一次提出脓毒症的共识定义，人们对脓毒症这种复杂综合征的临床特征和预后认识有了更新的认识，形成了一个更简单的脓毒症分类方案。然而，现有脓毒症的定义仍然不精确，不能准确筛查出所有的感染患者。此外，除了症状和体征，脓毒症的结局还与年龄、感染源以及治疗干预的时机和适当性有关(图1)。目前，利用新的高通量转化工具和分析方法根据不同的宿主反应将脓毒症患者分组，从而理解不同患者的病理生物学驱动机制是一个有希望的发展方向。现在人们已经普遍认识到，可以利用生物标志物对脓毒症进行分类，并且可以帮助识别不同的患者亚类或亚型。

    过度的免疫激活和免疫抑制都是脓毒症的病理生理学中心环节。临床中，免疫抑制患者易患医院获得性感染。然而，重症监护病房(ICU)获得性感染的发生并不仅限于脓毒症患者，事实上，因非感染性疾病入住ICU的患者患医院获得性感染的机率与脓毒症患者相近。这表明，宿主免疫反应以外的机制也起到了作用，关键的靶向通路是内皮激活，凝血障碍，糖和蛋白质代谢异常。所有这些通路紊乱的内向型都已明确，他们的临床结局具有差异性，对治疗的反应也不同。

    本文中，我们将重点介绍转化生物学中一些有助于消除脓毒症患者的异质性的最新进展。重点是使用分子和代谢特征以及新的细胞功能研究来识别不同的脓毒症内型(表1)。识别脓毒症患者独特的生物学特征可以使我们能够合理地开展临床试验，更重要的是，可以提高我们对脓毒症的诊断、预后判断以及个体化治疗并调节患者对脓毒症的反应。

转录组分析

   最近有几个大的队列对脓毒症的转录谱个体间转录组变异进行了研究，均发现了免疫反应表型异常。这些研究的临床样本是从确定或可能感染的患者入院后24小时内抽取的外周血白细胞。然后应用大约25000个全基因组转录(基因表达微阵列和RNA测序)建档的无监督分层聚类来识别派生队列中不同的患者亚组，并且随后在至少一个验证队列中对该发现进行验证。这些复杂的数据驱动方法已经在表达的基因中确定了模式，这些基因代表了不同疾病状态的分子亚群，而不涉及临床结局，但可能与其相关。这种方法还可以提示个体发病前状态(年龄、合并症)、疾病阶段和严重程度、死亡率和遗传先兆的聚类。然而，不能根据这些临床特征来区分后文中的每一项研究的亚组成员。

    首批使用无监督分层聚类法研究ICU患者中脓毒症亚组的研究之一，是在美国因感染性休克入儿科ICU的98例儿童患者中进行的。通过全基因组差异表达模式鉴定出三个亚类：内型A(29%)、内型B(46%)和内型C(26%)。这三类患者在ICU病死率(A型最高，为36%，而B型和C型分别为11%和12%)、疾病严重程度和器官衰竭程度(均为A型最高)和年龄(A型最小)等临床表型上存在显著差异。这些亚类在生物学上也是可信的，内型A中最混乱的信号通路涉及到对适应性免疫系统、糖皮质激素受体信号以及锌稳态至关重要的基因的抑制。

    最近，类似的研究方法也被应用于成人危重患者。作为脓毒症基因组进展(GAinS)研究的一部分，英国265例因社区获得性肺炎(CAP)引起脓毒症而入院的29个ICU患者中，转录图谱确定了两种脓毒症反应特征(SRS1，41%和SRS2，59%)。与SRS2患者相比，SRS1组患者的14天死亡率更高(22%比10%)。SRS1的分组与相对免疫抑制、内毒素耐受、T细胞耗竭、人类白细胞抗原(HLA)Ⅱ类分子下调和代谢紊乱(从氧化磷酸化转变为糖酵解)相关。在3000多个差异表达基因中，有7个基因可靠地预测了SRS成员的分组。在未来的研究中，预期被分配到SRS1的患者可能从增强免疫和预防医院感染的治疗中获益。

    随后，研究组人员使用同样的分析方法研究了117例粪性腹膜炎(FP)患者的基因表达模式。再次确定了两个缺陷组(SRS1_FP，46%和SRS2_FP，54%)，SRS1_FP组的患者14天死亡率也较高(19%比4%)。该研究与CAP研究中的SRS分组方法有很强的相关性，患者再次出现了内毒素耐受性增强和T细胞活化，但也出现了细胞死亡、凋亡和坏死。在1000多个差异表达的基因中，一个更简单预测患者分组的六基因集被推导出来。值得注意的是，当在上述的儿科队列中测试区分SRS组的基因表达模式时，没有观察到相同的富集(即SRS1_FP和内型A)。

    脓毒症分子诊断和风险分层(MARS)项目的部分研究中，对荷兰两个ICU收治的306例患者，鉴定出四种分子内型(MARS 1-4)。患者的28天死亡率在不同的亚组之间有差异，MARS1组的死亡率最高，为39%，而MARS2组为22%，MARS 3组为23%，MARS 4组为33%。预后不良的MARS1内型的先天和获得性免疫功能相关的基因(Toll样受体、核因子-κB信号[NF-κB]、抗原递呈和T细胞受体信号)表达减少，细胞代谢途径(血红素生物合成)表达增加，这两个过程都类似于免疫衰竭。MARS2和MARS4内型的模式识别和细胞因子途径(白细胞介素(IL)-6、NF-κB、干扰素信号转导、诱导型一氧化氮合酶)有上调，表现为高炎症状态。而MARS3是一种低风险内型，它的适应性免疫途径(T辅助细胞、自然杀伤细胞、IL-4信号、B细胞发育)的表达增强，与低危SRS2内型高度相关。在ICU入院时，应该推导出一个双基因表达率，以便能够对每种内型进行分类。

    在最近一次识别脓毒症亚型的最新和全面的尝试性研究中，来自700例患者的14个转录数据集的数据显示，脓毒症谱系中有三个强大的宿主反应簇。这些反应簇被称为：(1)炎症性(以IL-1受体表达增加、模式识别受体活性、补体激活为标志的先天免疫信号增加，且获得性免疫信号减少)；(2)获得性(以干扰素信号为标志，先天免疫信号减少，获得性免疫信号较高，死亡率较低)；以及(3)凝血性(凝血和补体系统异常，包括血小板脱颗粒和糖胺聚糖结合)。与以前的分析相似，三组的30天死亡率有差异，炎症性组的死亡率最高，为30%，而适应性组和凝血性组的死亡率分别为8%和25%。简化了33个基因的分类器，以便于聚类分配。高死亡率炎症类群对应于SRS1，低死亡率适应类群对应于SRS2。

    在ICU入院时，早期的转录变化也可能确定了脓毒症相关并发症的风险。本课题组对57例脓毒症患者进行的一项研究发现，感染后最初的中性粒细胞反应的关键介质的不同表达可确定区分患有急性呼吸窘迫综合征(ARDS，n=29)的患者与没有ARDS的脓毒症患者(n=28)，而这一发现并不能归因于中性粒细胞计数。

    到目前为止，脓毒症的全基因组表达研究使用的是整个白细胞群体。然而，粒细胞和淋巴细胞亚群之间存在着不同的基因表达模式，它们代表了各个免疫细胞的特殊功能。由于转录组图谱取决于炎症细胞类型，因此区分亚类的基因表达模式可能反映了不同的白细胞群体，而不是细胞内基因表达的差异。这些发现还需要在覆盖不同国家的大型队列中进行验证，因为种族背景的差异是基因表达的一个重要决定因素。

   然而，这些研究提供了不同种类的宿主对脓毒症反应的证据，以及基于区分患者内型的不同表达的分子通路的潜在的新的治疗靶点。此外，每项研究都建议将高维数据潜在地“缩小”为可管理的预测信号，这些信号可以应用到更确切的医疗点测试中，帮助将研究结果转换到临床。

mRNA 及蛋白质信号

   更成熟、更可行的脓毒症患者生物分类方法是血浆蛋白定量，大量研究已经使用这种方法对脓毒症进行分类，本综述不予详述。值得注意的是，可以结合分子和蛋白质生物标记物进行脓毒症亚类，从而预测脓毒性休克患者的预后。这一方法被用来对儿童脓毒性休克进行风险分层，使用先前验证的由五个血浆蛋白生物标记物组成的风险评分(Perevere决策树)，并将其与四个顶级死亡率评估基因相结合。在估计28天死亡风险的风险评分(Perevere-XP，受试者工作特征[AUROC]曲线下面积从0.78增加到0.91)方面有明显改善。血浆生物标记物与功能性炎症和细胞损伤有关，而相关基因与肿瘤蛋白53(TP53，p53)有关，肿瘤蛋白53是一种转录因子，起着抑制肿瘤的作用，阻止有基因组损伤的细胞的产生和持续存在。综上所述，这一方法提出了一个关于脓毒性休克导致不良预后的生物学途径的合理假设。

代谢组学

   代谢组学是破解脓毒症异质性的一种逐渐兴起而不太为人所知的方法。它指的是对任何生物样本中的小代谢物进行的全面评估，呈现了基因表达、酶活性和生理状态的综合“快照”。用核磁共振(NMR)谱或质谱法可以在细胞、组织或生物体液(血液成分、尿液)中检测到5000多种代谢物，质谱法更灵敏，可以检测到低丰度的代谢物。代谢物可以包括内源(脂质、碳水化合物、氨基酸、核酸)和外源(微生物成分和副产品)化合物。内源性代谢物浓度的改变可能与生物途径有关，改变的幅度与疾病的阶段有关，显著放大了转录组和蛋白质组水平的变化。到目前为止研究仅进行了小样本量的回溯性样本收集。

    氢核磁共振（1HNMR）波谱被用来分析和比较来自脓毒性休克成人和ICU对照组患者的血清样本。共识别出60种代谢物，其中31种可以区分脓毒性休克和ICU对照组，提出了一种可区分这两组患者的复合生物标志物模式。代谢产物涉及能量代谢，包括葡萄糖、3-羟丁酸、O-乙酰肉碱、琥珀酸、肌酸、磷酸肌酸以及支链氨基酸和精氨酸水平降低。这些结果提示，脓毒症早期参与能量代谢的代谢产物在脓毒症的病理生理过程中起一定作用。

   参与能量代谢的代谢物的改变也被认为是区分脓毒症幸存者和死亡者的关键，用质谱来表征血浆中较低浓度的代谢物。在ALBIOS(白蛋白意大利结局脓毒症)试验的一个子研究中，纳入了1818例严重脓毒症或脓毒性休克患者，研究了20例患者第1天和第7天的血浆样本，其中45%的患者在第28天前死亡。这项研究确定了137种代谢物，其中许多在幸存患者和死亡患者之间存在显著差异。最值得注意的一组代谢物包括磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰胆碱的减少以及犬尿氨酸的增加。脂质种类的减少，特别是长链多不饱和脂肪酸的减少，可能会导致T细胞活化增加和免疫反应过度。

    对参加社区获得性肺炎和脓毒症结果诊断(CAPSOD)研究的1152例疑似脓毒症患者中的150例患者的血浆代谢组进行了类似的质谱研究。在分析的439种代谢物中，在第0天(T0)和24小时(T24)都检测到214种代谢物。不同感染病原体(肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌或大肠杆菌)的代谢物在任一时间点均无差异。在28天时，脓毒症幸存患者和死亡患者之间有76种代谢物和128种代谢物在t0和t24之间存在差异。所有脂肪酸长度(中链或短链)和支链氨基酸生化组的酰基肉碱酯在两组患者之间差异最为显著，提示脂肪酸β氧化缺陷可能发生在肉碱穿梭水平。包括脂肪酸运输、糖异生和柠檬酸循环在内的代谢物也有不同程度的紊乱。

   另一个使用代谢组谱的质谱研究对60例ICU幸存者和30例ICU死亡患者的代谢物生物标记物进行的大型队列研究发现，在所测试的187种代谢物中，57种与28天死亡率相关，其中31种与在CAPSOD验证队列中发现的相重叠。这些代谢物包括不同的脂肪、碳水化合物、氨基酸和核苷酸产物。较高水平的酪氨酸和苯丙氨酸分解产物以及较低水平的脂质代谢产物与死亡率相关。虽然这项研究使用了与先前描述的研究相同的代谢物数据集，但发现了一个完全不同的代谢物网络，也可以预测28天的死亡率，这意味着现在关注单个代谢物生物标志物还为时过早，因为可能有数个代谢物生物标志物与脓毒症不同阶段的病理生物学有关。

    用质谱研究脓毒症患者代谢产物的最大的一项研究纳入了406例患者，其中268例纳入发现队列(全身炎症反应综合征42例，CAP 67例，腹腔感染60例，尿路感染73例，血液感染26例)。再次验证了，相对于全身炎症反应综合征，脓毒症患者的酰肉碱和脂类发生了改变。鞘氨醇-脂质SM C22：3和甘油磷脂溶解PCaC24：0模型区分了这两类患者，AUROC为0.9。分析还表明，根据感染源的不同，代谢物模式具有很大的异质性，因此提出了一个单一代谢物模型来预测每种感染类型的不良预后。

细胞功能

    虽然分子、蛋白质和代谢生物标记物提供了脓毒症与其结局之间的联系，但它们不能确定因果关系，需要进行将这些联系与脓毒症病理生物学联系起来的机制研究。两种潜在的高通量技术可用于研究细胞功能和脓毒症病理生物学之间的体外关系，包括流式细胞术和电细胞-底物阻抗传感(ECIS)。

    免疫表型包括使用流式细胞仪和荧光标记的单克隆抗体来同时进行多个细胞表面标记，例如那些与免疫功能障碍相关的标记。在从英国4个ICU招募的138名ICU患者中，中性粒细胞CD88和单核细胞HLA-DR减少以及调节性T细胞(CD4+，CD25++，CD127 low)比例升高所标志的白细胞功能障碍与医院感染的发生有关。脓毒症也存在淋巴细胞功能障碍，可通过促进细胞凋亡的程序性死亡蛋白1(PD1)及其配体PDL1的表达水平来定量。22例脓毒症患者外周血单个核细胞与健康对照组比较，脓毒症患者所有淋巴细胞亚群(CD4T细胞和B细胞)的PD1和PDL1均升高。类似于脓毒症的转录组和代谢组分析，早期的先天和获得性免疫状态也因感染类型不同而出现差异。因此，可对具有特定的感染源、免疫表型可修改为免疫调节治疗的患者进行精确的药物引导治疗。

    内皮是脓毒症的主要受累靶点之一。在体外测量内皮细胞功能非常困难，但我们的研究小组开发了一种新的检测方法(ECIS)，该方法描述了暴露于不同患者来源的样本后内皮细胞反应的异质性。这个测试是基于电流在单层内皮细胞上的运动，电阻的降低表明血管通透性的增加。当肺内皮细胞暴露于脂多糖(LPS)刺激的来自35例脓毒症ICU患者的白细胞上清液时，观察到肺内皮细胞通透性的显著异质性。同样的方法也被用来测试脓毒症患者的中性粒细胞诱导内皮损伤的能力，结果表明，与没有发生ARDS的患者相比，患有ARDS的脓毒症患者的中性粒细胞可以诱导更大的内皮损伤。这种血管通透性的体外模型可能有助于测试研究减轻脓毒症早期内皮损伤的治疗药物。

面临的挑战及未来的方向

    在脓毒症中识别持续存在的生物异质性需要克服几个技术障碍。首先应该统一不同地方的纳入标准，以最大限度地减少患者选择偏倚。样本采集的时机是至关重要的，因为内型分配是一个动态的过程，近50%的患者在ICU入院的前5天内从一种内型交叉到另一种内型，连续几天的连续抽样证明了这一点。同样，基因表达改变的持续时间在不同的患者之间可能有所不同，在康复较快的患者中往往会更快地恢复正常，强调标准化样本的收集时间是至关重要的。数据收集也需要标准化，以包括常见的临床有意义的结果，因为到目前为止的研究使用的是ICU、住院、14、28、30或90天的死亡率。这些结果代表了可测量的不同生物学过程的不同终点。早期死亡更有可能直接归因于最初的脓毒症发作，而晚期死亡可能反映了脓毒症的并发症，而不是医院感染。在分析阶段，标准化的分析方法对于确定脓毒症是否可以分成两种、三种、四种或可能更多的内型将是重要的。

    宿主对脓毒症的反应很有可能是非特异性的，并且可能被不同的生物体所诱导，这些生物体侵袭不同的器官。尽管有证据表明，无论感染类型(革兰氏阳性脓毒症和革兰氏阴性脓毒症)或感染的解剖来源是否不同，在转录组和代谢组水平上可能存在共同的宿主反应，但迄今为止对这些问题进行的研究相对较少，并且当使用汇集的数据时，有宿主基因表达特征可以区分无菌炎症和细菌或病毒感染。因此，迄今为止最大规模的转录谱分析仅限于细菌性脓毒症。此外，当包括肺炎和腹膜炎这两种最常见的解剖学感染源的患者在内的所有原因所致脓毒症的基因表达数据被重新分析后，被分配为一种内型的患者的比例因感染源的不同而不同。代谢物也因感染源不同而不同，与其他感染部位相比，CAP具有不同的代谢物模式。最近对H1N1肺炎血浆代谢组的分析成功地将病毒与细菌培养阳性肺炎和呼吸机ICU对照区分开来。因此，脓毒症内型是否真的独立于感染类型和解剖来源，仍将需要有足够强度的大规模前瞻性队列研究来解决这个问题。

    在未来，根据代表不同生物学途径的信号来治疗宿主对脓毒症反应的不同表现是可能的(图2)。对内型的分配可以促进针对通路紊乱的内型组进行适当的治疗，这将使患者受益最大化。它还将使研究通路驱动疗法的临床试验能够进行适当的选择，迄今为止，这些试验主要是由于纳入了一组异质脓毒症患者而未获成功。

    在探索和发现过渡到测试候选mRNA、蛋白质和代谢物模型之前，需要在大型、多中心和多样化的队列中进行验证。未来合作研究的总体目标应该是在大规模队列中进行前瞻性验证，以确定在ICU入院时由病理生物学、生物标记物驱动的脓毒症内型鉴定是否可以改善临床结局和个体化治疗。

总结

   应用生物信息学将系统生物学(转录组学、蛋白质组学、代谢组学)与功能细胞研究相结合，具有识别生物内型的潜力，而仅采用临床协变量是无法进行内型预测的。优化这些新的转换方法将需要专业的、标准化地进行患者样本收集、样本检测和数据分析。宿主对脓毒症反应的异质性的真正本质可能是分子、蛋白质、代谢和功能特征的结合，这将形成一个完整的、简单的和可用于临床的诊断模型，该模型可以在患者入ICU时迅速使用。充满希望的是，一组简化的生物标记物将被用来进行患者的特定亚型分类，这将有助于测试特定的新疗法。当然，临床中关键生物标志物和临床指标的检测可以改善我们精准化医学指导疗法和脓毒症患者的预后。