四、真菌感染相关生物标志物
1．(1，3)-β-D-葡聚糖(BG)：BG检测也称为G试验。葡聚糖广泛存在于真菌细胞壁中，占其干燥重量的80%～90%，其中BG占真菌壁成分的50%以上，是真菌细胞壁上的特有成分。其存在形式是以(1，3)-β-糖苷键连接的葡萄糖残基骨架作为主链，分支状1-6-β-D葡萄糖残基作为侧链。当真菌进入人体血液或深部组织后，经吞噬细胞的吞噬、消化，BG可从胞壁中释放出来，从而使其在血液及其他体液中的含量增高。而在浅部真菌感染中，BG往往未被充分释放，故其在体液中的含量不高。此外，接合菌(毛霉、根霉等)细胞壁不产生BG；隐球菌细胞壁外有荚膜包裹，不易检测到细胞壁上的抗原，即使在一定条件下荚膜自身可释放出微量的BG到血清中，但仍小于阳性判断标准[100]。G试验是早期诊断侵袭性真菌感染(IFI)有效的无创检测手段之一，研究结果显示，在发现临床表现及微生物学证据前，血清中BG水平已经高于正常值。如粒细胞缺乏患者中，BG>60 ng/L的时间比临床诊断与最后确诊IFI平均提前10 d左右[101]。BG水平高低也可提示疾病的发展和预后，Pazos等[102]发现，随着有效抗真菌药物的应用，可很快出现BG水平下降及转阴，而药物治疗无效的人群BG值无明显改变。虽然连续监测BG水平对于IFI的治疗效果及预后评估均有意义，但尚不能单凭BG值降至正常作为停止抗真菌治疗的标准。目前市场上有多种G试验方法，不同方法使用的阳性界值标准也不同，如日本Seikagaku Kogyo公司Fungitec-Gglucan试剂的阳性界值定为20 ng/L，而美国CapeCode协会Fungitell方法的阳性界值常为60 ng/L。Karageorgopoulos等[103]的一项荟萃分析结果显示，G试验在确诊和拟诊IFI的敏感度为76.8%，特异度为85.3%，在确诊患者中的诊断敏感度为79.1%，特异度为87.7%。Posteraro等[104]发现，对于念珠菌脓毒症患者，G试验的阳性预测值为72.7%，阴性预测值为98.7%。Racil等[105]发现在诊断阈值为60 ng/L时，G试验的敏感度为88.9%，但特异度只有19.77%，阳性预测值为10.39%，阴性预测值为94.44%。综上所述，在诊断IFI时，G试验具有较高的敏感度，阴性结果可较好排除肺部真菌感染，但部分研究的阳性预测值较低，这可能与导致假阳性的各种因素有关，如输注白蛋白或球蛋白、血液透析、输注抗肿瘤的多糖类药物、使用磺胺类药物、外科手术后及标本接触纱布等[106]。
2．半乳甘露聚糖(GM)试验：GM检测也称为GM试验。GM是广泛存在于曲霉和青霉细胞壁中的一类多糖，其基本化学结构是以β-(1，4)-苷链连接成的D-吡喃甘露糖为主链，以α-(1，6)-苷链连接成的D-吡喃半乳糖为支链，其半乳糖残基具有抗原性。侵袭性曲霉感染的确诊要求组织或细胞病理见到真菌及其引起感染的证据，或无菌部位培养曲霉生长，但组织标本不易得到，培养也需要较长时间。2003年美国食品与药品监督管理局已经通过认证，把应用酶联免疫吸附方法检测血清GM试验作为造血干细胞移植(HSCT)患者和白血病患者深部曲霉感染的辅助诊断方法。研究结果表明，对于深部曲霉感染的患者，血清GM试验增高可比影像学诊断提前7 d左右出现[107]。在重症感染患者，动态监测GM试验水平，可有助于判断真菌播散程度、治疗反应和预后[108]，Maertens等[109]和Boutboul等[110]发现，粒细胞缺乏和造血干细胞移植后的侵袭性曲霉病患者，治疗效果较好者血清GM试验结果稳定或下降，而病情加重或治疗失败者则明显升高。GM检测方法有酶联免疫吸附试验(ELISA)、放射免疫分析(RIA)和乳胶凝集试验(LAT)等，最低检测限度要求达到5～10 ng/L。目前国内外血清GM试验阳性阈值仍难统一，美国食品药品监督管理局建议判断标准为0.5 μg/L，欧洲普遍使用的判断标准为0.7～1.0 μg/L，国内也多以0.5 μg/L作为标准。较早的一项荟萃分析结果表明，界值为1.0 μg/L时，确诊病例中GM试验的敏感度为68%，特异度为90%；当界值降至0.5 μg/L，敏感度升高至82%，特异度降至77%[111]。最近国内对4种不同的阳性界值(0.5、0.6、0.8和1.0 μg/L)的研究结果显示，采用0.5 μg/L为临界值时，敏感度及特异度均较好，有助于早期诊断及治疗[112]。检测血液外其他体液如BALF、尿液及脑脊液中的GM试验，对辅助临床诊断也可起到重要作用。研究结果表明，当采用0.5 μg/L为临界值时，BALF的GM试验对诊断的敏感度为70%～94%，特异度为85%～92%[113]。研究结果证实，GM检测对于恶性血液疾病及骨髓造血干细胞移植患者的侵袭性曲霉感染的诊断具有重要价值，但是否同样适用于非粒细胞缺乏患者，尤其是对合并肺部基础疾病患者早期诊断的价值仍有较大争议[114]。几项针对非粒细胞缺乏患者侵袭性肺曲霉病的诊断研究结果表明，当采用0.5 μg/L为临界值时，确诊病例中血清GM试验的敏感度为40.7%～57.9%，特异度为84.2～89.4%[115,116,117]，这些患者血清GM试验的敏感度要低于恶性血液疾病及骨髓造血干细胞移植患者。BALF的GM试验可能对非粒细胞缺乏患者肺侵袭性曲霉感染有较大的诊断价值，若以0.95 μg/L为临界值，BALF中GM试验诊断非粒细胞缺乏患者侵袭性肺曲霉病的敏感度为73.9%，特异度为88%[118]。此外，如果将PCR检测血曲霉DNA或G试验与GM试验结合起来，也可提高诊断的准确性[119]。GM试验可出现假阳性及假阴性现象。假阳性可见于静脉用哌拉西林-他唑巴坦，使用免疫球蛋白、血液制品，高剂量肾上腺皮质激素，透析，化疗导致严重黏膜炎的患者以及儿童和新生儿等。假阴性的产生与血中存在高滴度抗体、血液中真菌数量较少和抗原释放水平低有关。另外，预防性使用抗真菌药物可降低GM试验值导致出现阴性结果[119,120]。为减少假阳性及假阴性结果，我国制定的”肺真菌病诊断和治疗专家共识”中将连续2次血清GM试验阳性作为曲霉感染的辅助诊断标准[106]。但许多患者常因早期经验性抗真菌治疗，GM试验结果可能已出现降低，造成间隔较长的连续血清GM试验监测的后一次试验结果为阴性。GM试验阴性不能完全排除侵袭性曲霉病，单纯GM试验阳性也不是确诊的依据。
3．隐球菌荚膜多糖抗原：隐球菌感染后在体内可形成大量荚膜多糖并释放入血液和脑脊液，通过检测血清和脑脊液等中的荚膜多糖抗原含量可早期、快速诊断隐球菌感染。目前使用的检测方法有乳胶凝集法(latex agglutination，LA)、酶联免疫法(enzyme immunoassay，EIA)和侧向层析法(lateral flow assay，LFA)等，其中以LFA法最快速，而临床实践中LA法最为常用[120]。LA法是将抗隐球菌荚膜多糖抗体吸附于标准大小的乳胶颗粒上，用于检测患者血清、脑脊液、BALF及尿液等标本中的隐球菌荚膜多糖抗原。用标本稀释液倍比稀释被检液体，取倍比稀释后的被检液体样本与乳胶试剂混合。结果判读：(1)无颗粒，均匀的乳浊液；(＋)：细小颗粒，乳白色背景；(＋＋)：小凝块，云雾状不均匀背景；(＋＋＋)：小及大凝块，背景悬浮液；(＋＋＋＋)：大的絮状凝块，背景清晰。参照乳胶凝集法试剂盒要求，取≥(＋＋)的结果为阳性结果，效价值为此时的稀释倍数。质量控制：阳性质量控制品效价≥(＋＋)，阴性对照品效价<(＋)。目前市售试剂盒可以检测出最低为10 μg/L的荚膜多糖抗原，文献报道该方法的敏感度为91.1%～100.0%，特异度为96%～100%[121,122,123,124,125]。血清或脑脊液荚膜多糖抗原滴度增高提示预后不良，高滴度(> 1∶1 024)与全身高隐球菌负荷和隐球菌高定量计数有关，是患者在接受全身系统抗真菌治疗期间预后不良的预测因素之一[126]。Baddley等[127]的研究结果提示，局限性肺隐球菌病患者血清中较难检测到隐球菌抗原，如果血清中抗原滴度上升则提示该患者有播散的可能。在中枢神经系统感染时，血清抗原滴度常大于脑脊液的滴度[126]。此外，通过动态监测荚膜多糖抗原滴度，结合其他临床因素可作为制定治疗方案的参考。有效治疗后，一般抗原滴度会逐渐降低，抗原滴度持续升高则提示感染未有效控制或产生耐药[128,129]。但在感染治愈后，许多患者乳胶凝集试验阳性仍可持续相当长时间[128]。LA法检测隐球菌荚膜多糖抗原存在着非特异性干扰，类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、结节病和结核等患者血清中的类风湿因子、巨球蛋白会对乳胶凝聚法产生影响，可导致假阳性结果，某些隐球菌外菌种如丝孢酵母菌感染也可引起假阳性[130]；假阴性结果主要由前带效应(系指虽有一定浓度的抗原存在，但因抗体过剩使反应信号弱化，出现弱阳性或阴性反应结果)引起，为避免前带效应的影响，除多次送检外，还可对试剂中抗体进行一定稀释后再检测。EIA法的敏感度和特异度与LA法类似，但其结果不受类风湿因子等的干扰，可以实现自动化结果分析；LFA法运用了能和4种主要血清型隐球菌抗原反应的单克隆抗体，其敏感度为99.5%，特异度为98%，且该方法在室温下很稳定，反应时间快，10 min出结果，对实验室条件要求较低，也可作为床旁初筛的方法[131]。
五、结核病相关标志物
γ-干扰素释放试验(IGRAs)：IGRAs是检测已受到结核分枝杆菌(MTB)抗原刺激致敏的T细胞，再次遭遇同类抗原后，释放γ-干扰素的细胞数目或释放出γ-干扰素水平的方法。与传统的PPD试验相比，该方法较少受到接种卡介苗与非结核分枝杆菌(NTM)的干扰，对辅助诊断活动性结核病与MTB潜伏感染(LTBI)有一定参考价值。LTBI是指宿主感染MTB后的一种特殊状态，此时MTB在宿主体内处于滞留状态，有发展为活动性结核病的风险，世界卫生组织建议一旦确诊应适当采取对策[132]。应用于IGRAs的特异性抗原主要为早期分泌抗原靶(ESAT-6)和培养滤液蛋白(CFP10)抗原，也有的试剂中又增加了TB7.7抗原多肽，前两种抗原主要存在于MTB复合群中，而在卡介苗和大多数NTM中缺失，因此提高了IGRAs对MTB的特异度。但值得注意的是ESAT-6和CFP10也可存在于少数几种NTM中，比如堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌和胃分枝杆菌等。因此，IGRAs阳性仍不能排除上述NTM感染或LTBI的可能性。目前较成熟应用在临床的IGRAs有两种，一种是采用ELISA，检测全血中致敏T细胞再次受到MTB特异性抗原刺激后释放γ-干扰素的水平，称为全血检测或结核感染T细胞免疫检测(QFT-GIT)。另一种是采用酶联免疫斑点技术(ELISPOT)，测定外周血单个核细胞中能释放γ-干扰素的效应T细胞数量，称为细胞检测或结核感染T细胞检测(T-SPOT.TB)，目前在我国各地医院应用较为普遍的是后一种检测方法。QFT-GIT法分为阴性对照组(N)、阳性对照组(P)和检测标本组(T)，其结果判断方法为：N<0.5 IU时，(T-N)/(P-N)≥0.60时判为阳性，否则为阴性；当N≥0.5 IU时，(T-N)/(P-N)≥0.85时判为阳性，否则为阴性。T-SPOT.TB法测定的是可释放γ-干扰素的T细胞数量，经酶联免疫显色后，通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数，1个斑点代表1个细胞，计算出抗原特异性细胞出现的频率。结果判断方法为：在阳性对照孔结果良好的前提下，当阴性对照孔斑点数为0～5时，阳性标本应为：(抗原A或抗原B斑点数)减去阴性对照孔斑点数后>6；当阴性对照孔斑点数≥6时，阳性样本应为：(抗原A或抗原B斑点数)>2×阴性对照孔斑点数。Sester等[133]的荟萃分析结果表明，在诊断活动性结核病时，T-SPOT.TB总体的敏感度和特异度分别为81%(95%CI为78%～81%)和59%(95%CI为56%～62%)；QFT-GIT总体的敏感度和特异度分别为80%(95%CI为75%～84%)和79%(95%CI为75%～82%)。另一项荟萃分析评价了IGRAs在中低收入国家对活动性结核诊断时的价值，T-SPOT.TB总体的敏感度和特异度分别为83%(95%CI为63%～94%)和61%(95%CI为40%～79%)，QFT-GIT总体的敏感度和特异度分别为69%(95%CI为52%～83%)和52%(95%CI为41%～63%)[134]。这些研究结果提示，仅凭IGRAs诊断活动性结核并不可靠，特异度较低，有可能将部分LTBI患者误诊为活动性结核。另外一项包含26 680例患者的荟萃分析结果也表明，与PPD试验类似，IGRAs试验无法更好预测活动性结核病的发生[135]。在诊断LTBI方面，Pai等[136]的系统评价结果提示，QFT-GIT的总体敏感度为70% (95%CI为63%～78%)，在接种卡介苗患者的总体特异度为96% (95%CI为94%～98%)，未接种者为99% (95%CI为98%～100%)；T-SPOT.TB的总体敏感度为90% (95%CI为86%～93%)，总体特异度为93% (95%CI为86%～100%)。PPD试验结果则异质性较大，只在未接种卡介苗者中诊断的特异度较高[97%(95%CI为95%～99%)]。
综上所述，仅凭IGRAs阳性不能区分活动性结核病与LTBI，也不能预测LTBI是否会发展为活动性结核病，但IGRAs阴性对排除MTB感染有一定帮助。与PPD试验相比，IGRAs不受卡介苗接种与否的影响，也较少受NTM感染的影响，如用于HIV感染人群中筛查LTBI，其敏感度会更高[137]。
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