多重耐药铜绿假单胞菌导致的难治性感染是临床工作中面临的难题。由于铜绿假单胞菌对许多抗生素存在固有耐药，因此如果采用现有的抗铜绿假单胞菌活性药物单药治疗，非常易于产生耐药而导致治疗失败。单在美国，2017年就发现了大约3200例多重耐药铜绿假单胞菌感染患者，导致2700例患者死亡。世界卫生组织（WHO）已将耐碳青霉素类药物的铜绿假单胞菌确定为最亟需新治疗方法的病原体之一。但不幸的是，药物开发往往跟不上对新抗生素的需求，其中包括抗铜绿假单胞菌活性药物。因此，我们迫切需要治疗多重耐药病原菌的替代方案，比如改良现在已有的抗生素治疗方案等。
临床上我们发现多重耐药革兰氏阴性菌对近年来新上市的抗生素发生耐药现象，这迫使我们将目光再度投向过去曾经被弃用的一些抗生素，比如多粘菌素。多粘菌素是一组非核糖体脂肽，目前临床上只有多粘菌素B和E（粘菌素）可以使用。多粘菌素B和E只有一个氨基酸的区别，作用和活性谱几乎相同。由于这类抗生素具有显著毒性（主要是肾毒性），曾经被临床弃用。大约60%静脉使用多粘菌素的患者会发生肾毒性。然而，多粘菌素显示对许多多重耐药革兰氏阴性菌有显著的体外活性，包括铜绿假单胞菌。因此它们的使用量在过去的二十年里稳步上升。在许多情况下，它们是多重耐药病原体抗感染治疗的唯一可选择治疗方案。
然而同其它抗生素一样，随着多粘菌素使用量增加，患者难以避免出现对多粘菌素的耐药现象，并且在世界范围内传播，威胁到了这个在临床上日益重要的最后一道治疗方案的疗效。为了应对这一严峻问题，有学者提出多粘菌素联合治疗方案以增加抗菌活性、减少耐药产生。在一项研究中，研究者探讨了以多粘菌素B为基础的联合方案应用于产生物膜、多粘菌素耐药的多重耐药铜绿假单胞菌的治疗。
研究采用了两种基因不同的临床多重耐药铜绿假单胞菌株，分别是FADDI-PA060和FADDI-PA107。基因测序显示两种菌株都含有抗生素耐药基因（FADDI-PA060有55个基因，FADDI-PA107有52个基因）。这些基因包括编码抗喹诺酮类、大环内酯类、氨基糖苷类、碳青霉烯类和头孢菌素类耐药基因。通常这些耐药基因对特定一类抗生素耐药，与最低抑菌浓度（MIC）升高相关。表1显示了抗生素MIC值。两株菌均对多粘菌素耐药，其中FADDI-PA060对美罗培南耐药，FADDI-PA107对美罗培南敏感。与多粘菌素B高水平的MIC相符的是，在16mg/L多粘菌素B存在的情况下，两株菌接种浓度达到108 CFU/mL后均能继续生长，显示基线时没有亚菌群异质性存在。在毒力评估方面，FADDI-PA060菌株共有249个毒力基因，FADDI-PA107菌株共有220个毒力基因。这些遗传毒力基因显示，两种菌株都产生生物膜，在体外也得到了证实。
确定了两株菌的耐药情况和毒力基因后，研究者进行了以多粘菌素为基础的抗生素联合方案筛选，使用了多种临床相关药物浓度去确定潜在的有效抗生素组合。图1的Checkerboard实验结果显示，与多粘菌素B协同作用最显著的是美罗培南和利福平。然而由于利福平有许多毒性问题，因此研究者选择临床上更常用的广谱抗菌活性强且安全范围宽的美罗培南作为联合治疗药物，并进一步研究其对游离菌的杀菌活性、生物膜形成的抑制作用以及对细菌膜完整性的影响。
生物膜形成是细菌对环境因素应激诱导的反应。在存在体内植入物如导管、起搏器、假体设备和血管移植物的患者中，生物膜相关感染的风险尤其高。大约60%-70%的院内感染与植入医疗设备有关，其中导管相关的院内感染占了所有医院相关感染的36%。对于肺囊性纤维化患者，肺内生物膜形成加重了非特异免疫反应介导的慢性炎症。一旦生物膜形成，与游离菌相比，生物膜可以增加对抗生素浓度的耐药性至10-1000倍，引起持续的感染，导致药物的清除成功率下降。因此，早期抑制生物膜的形成和进展能显著改善清除细菌的成功概率。这项研究结果显示通过多粘菌素B/美罗培南联合方案可以显著抑制生物膜形成。
初始生物膜形成实验显示，接种24小时后在缺乏抗生素的情况下，两种菌株都可以形成显著的生物膜。随后在动态生物膜形成实验（图2）中，接种24小时后FADDI-PA060菌株只有在暴露于多粘菌素B/美罗培南（每种药浓度16mg/L）的联合治疗组中，游离菌和生物膜内细菌的数量才比对照组和单药治疗组显著减少（p<0.05）。FADDI-PA107菌株情况类似，接种24小时后暴露于相同浓度的多粘菌素B/美罗培南联合治疗组没有检测到游离或生物膜包埋的细菌。而在其他治疗组中，两种菌株都可检测到大于4log10 CFU/mL的游离细菌和生物膜形成。
根据药物对生物膜形成的抑制作用，研究者对多粘菌素B和美罗培南（均为16mg/L）的联合方案进一步检测了时间依赖性杀菌效果（图3）。两种单药方案均对FADDI-PA060（美罗培南 MIC 64 mg/L）耐药。尽管多粘菌素B和美罗培南联合治疗后24 小时FADDI-PA060仍出现生长，但联合治疗使细菌数量减少了3 log10CFU/mL，并且治疗后 4 小时内没有检测到细菌生长。而美罗培南敏感菌株FADDI-PA107 （美罗培南MIC, 4mg/L），单用多粘菌素无效。虽然美罗培南单药治疗和联合治疗后（包括4MIC剂量）4小时均出现快速显著杀菌作用（~5 log10CFU/ml），但在24小时时美罗培南单药治疗出现细菌显著再生长（~4 log10 CFU/mL），而多粘菌素B和美罗培南联合治疗此时没有检测到存活菌。
图3. FADDI-PA060（A）和FADDI-PA107（B）采用多粘菌素B 16mg/L和美罗培南 16mg/L单药和联合治疗的时间杀菌曲线，接种量为~ 106 CFU/ml。虚线显示了检测低限1.30 log10 CFU/mL。三组重复实验数据采用平均值±标准差（n = 3）表示。
过去曾经报道多粘菌素对于多粘菌素敏感的菌株在用药第一个小时内即可达到快速杀菌的效果。在这项研究中多粘菌素B/美罗培南联合用药并不能增加对这些耐药菌株的早期杀菌活性。意料之中的是，对美罗培南耐药的FADDI-PA060菌株(MIC 64 mg/L)对药物的敏感性最低，多粘菌素或美罗培南单药治疗甚至在64mg/L时无法预防生物膜形成。然而对于美罗培南敏感的FADDI-PA107菌株，尽管美罗培南单药治疗（16mg/L）在最初4小时内显示出显著的杀菌效果，然而随着游离菌出现再生长，尽管使用了4倍MIC的美罗培南，仍可被检测游离菌和生物膜。只有同时使用16mg/L多粘菌素的联合方案治疗才能在用药后24小时清除细菌。
由于多粘菌素B和美罗培南联合治疗（16 mg/L）导致时间依赖性杀菌实验中FADDI-PA107细菌被完全清除，没有足够的细菌做进一步的研究，因此研究者采用治疗4小时后达到最大杀菌效果、并且24小时仍存活的FADDI-PA060菌株进行膜完整性实验。图4显示了治疗引起的FADDI-PA060膜极性和膜通透性变化。膜去极化用DiBAC荧光强度检测。多粘菌素B单药治疗后荧光曲线发生了显著偏移，74.8%细菌细胞的荧光强度大于对照组。在74.8%细胞内，一小部分细胞有显著更高的DiBAC免疫荧光，显示这些细胞存在膜的去极化。在美罗培南单药治疗后，81%细菌的膜极性与对照组相似，剩余的18.4%细胞出现了显著去极化，与多粘菌素B单药治疗去极化亚群相似。
然而，暴露于多粘菌素B和美罗培南联合方案后，99.5%的菌群经历了显著膜去极化，与单药治疗的去极化亚群相似，但平均荧光强度显著高于对照和单药治疗组。膜通透性用碘化丙啶荧光检测显示，结果与DiBAC检测相似。一小部分细胞在单药和联合治疗后膜通透性增加，使整个荧光曲线迁移至右侧，几乎所有的细胞均出现显著升高的碘化丙啶荧光（p<0.05），联合治疗后细胞膜的通透性显著增加。
联合治疗中每一种抗生素不同作用机制和耐药机制有利于增强杀菌效果。多粘菌素对革兰氏阴性菌的靶点是外膜的脂多糖（LPS）。多粘菌素阳离子有机胺和LPS上阴离子磷和羧化物之间的静电吸引是抗生素活性的关键机制。多粘菌素和LPS结合引起二价阳离子间替换，外膜结构重构，最终导致细胞死亡。膜破坏不仅增加了对多粘菌素的通透性，并且对其它化合物的通透性也增加。目前已经确认的多粘菌素耐药机制包括LPS改变，使多粘菌素和LPS之间的相互作用无效。本次研究中的两种菌株都是多粘菌素耐药的，但多粘菌素B对大多数细菌仍可引起显著的膜破坏（包括膜去极性和膜通透性增加）。多粘菌素引起的外膜结构破坏显著改善了美罗培南对靶蛋白（细胞浆膜外侧的青霉素结合蛋白）的接触机会。多粘菌素治疗使美罗培南细胞内浓度增加，可以帮助减轻碳青霉烯酶引起的酶失活和外膜蛋白孔OprD表达下降导致的美罗培南耐药。
临床上，多粘菌素B静脉给药往往使肺泡上皮衬液（ELF）浓度无法达到目前的推荐剂量。这是由于多粘菌素剂量限制的肾毒性妨碍了通过增加多粘菌素静脉给药达到更高浓度。目前吸入多粘菌素B和多粘菌素E经常作为其他抗菌药物的辅助治疗用于呼吸道感染，例如囊性纤维化患者和呼吸机相关性肺炎患者。吸入给药使大量药物直接到达靶点，并使全身暴露最小化。标准剂量的多粘菌素B吸入可以使ELF浓度稳定在16mg/L。对于β内酰胺类抗生素，抗菌活性与给药间隔期间非结合药物浓度维持在MIC以上（fT>MIC）有关。对于美罗培南，fT>MIC大于40%被认为是达到最大杀菌浓度必需条件。标准剂量静脉给药后美罗培南ELF浓度从5-30mg/L不等，因此静脉用药后美罗培南在上皮衬液中的浓度可以达到16mg/L。
总之，多粘菌素B和美罗培南具有协同杀菌作用，对于难治性多粘菌素耐药的多重耐药铜绿假单胞菌是一种有前景的联合治疗方案。目前这一方案的疗效仍有待于在动物感染模型中进一步证实，为临床上应用推广提供依据。
本文荟萃自医学界呼吸频道，只做学术交流学习使用，不做为临床指导，本文观点不代表数字日志立场。
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