中性粒细胞外陷阱在脓毒症发生机制中的研究进展

脓毒症(sepsis)每年造成全球数百万人死亡，是医院急救中心和重症监护病房中常见的急危重症。虽然近年来医学技术迅速发展，但脓毒症仍严重威胁人类健康，因此迫切需要脓毒症的早期识别方法和更有效的医疗干预措施。中性粒细胞是一种多功能先天性免疫细胞，当感染发生时趋化因子诱导中性粒细胞由血流迁移至感染部位，通过吞噬作用和生成中性粒细胞外陷阱(neutrophil extracellular traps, NETs)清除病原体。

NETs在脓毒症发生机制中起到了重要作用，本文就NETs的组成、形成过程、在脓毒症中的作用和潜在的治疗靶点作出总结，为寻找脓毒症早期诊断标志物及新的治疗手段提供思路。

1 NETs的组成

NETs是由解聚染色质形成的具有约25~50 nm直径大小不等孔的网状DNA结构，由核蛋白包被，包括组蛋白、颗粒蛋白(如弹性蛋白酶和髓过氧化物酶)和胞浆蛋白(如S100钙结合蛋白A8、A9和A12，以及肌动蛋白和α-肌动蛋白)^[1–2]。细胞游离DNA(cfDNA)、髓过氧化物酶-DNA(MPO-DNA)、瓜氨酸化组蛋白H3-DNA(citH3-DNA)、弹性蛋白酶-DNA(NE-DNA)可间接反映脓毒症患者循环NETs的形成^[3–4]。

2 NETs的形成机制

NETs的释放过程称为“NETosis”，是一种不同于凋亡和坏死的程序式细胞死亡途径，该过程是在没有细胞裂解情况下发生的。目前报道了两种不同的“NETosis”^[5]：溶解性中性粒细胞外陷阱介导的死亡(lytic neutrophil extracellular traps mediated death)和重要的中性粒细胞外陷阱介导的死亡(vital neutrophil extracellular traps mediated death)，前者由生理诱导物刺激，中性粒细胞受到刺激后激活PKC-Raf/MERK/ERK通路，胞内颗粒蛋白向细胞核迁移，染色质解聚，核膜和颗粒膜的通透性丧失，混合核、颗粒物质和细胞质内含产物透过溶解的胞膜排出到细胞外，此过程依赖NADPH氧化酶，需要约120 min，NETs释放后中性粒细胞死亡，所以也被叫做自杀性“NETosis”^[6-7]。而后者由细菌或细菌产物刺激，细胞核失去多叶发育，DNA核萌发囊泡穿过细胞质，与质膜融合连同颗粒蛋白释放到细胞外，该过程不依赖NADPH氧化酶，且发生在30 min内^[8]。脓毒症主要通过溶解性中性粒细胞外陷阱介导的死亡途径生成NETs^[9]，NADPH氧化酶的功能失调可能是NETs形成的重要原因，将中性粒细胞与脓毒症患者的血浆或血清共孵育会促使大量NETs生成^[10]。

3 NETs在脓毒症中的作用3.1 捕获和直接杀伤

NETs主要通过形成物理屏障和直接杀死微生物来发挥抗菌活性^[11]，NETs通过细菌上正电荷与带负电的染色质纤维间的静电作用控制其转移，限制感染扩散^[12]。研究证实了具有快速溶解DNA功能的细菌毒力作用更强，如肺炎链球菌能够表达endA基因(能够降解DNA)，更易导致菌血症和败血症的发生^[13]。Bianchi等^[14]将慢性肉芽肿性疾病(一种NADPH氧化酶基因突变引起的家族性疾病)患者的中性粒细胞与构巢曲霉共培养，结果导致构巢曲霉生成增多。McDonald等^[15]研究观察到PAD4基因敲除小鼠的中性粒细胞杀死福氏志贺氏菌的能力降低，吞噬作用受到抑制。研究^[16]发现白色念珠菌菌丝上的β-葡聚糖会被补体受体3(CR3)所识别，诱导快速NETosis反应，释放NETs捕获并消除酵母或菌丝形式的白色念珠菌。此外，研究还报道了中性粒细胞能够联合巨噬细胞消灭结核分枝杆菌^[17]。

3.2 凝血功能紊乱和血栓形成

内皮结构与功能的完好是保证毛细血管内稳定的基础^[18]。血管内皮损伤在脓毒症血栓的发生和发展中起着重要作用，异常NETs生成可加重与血栓形成相关的内皮功能障碍。NETs可以通过TLR4/NF-kB信号通路促进内皮细胞释放炎性因子^[19–20]，还可以促进血小板粘附、活化、聚集，为血栓形成提供支架，而血小板、内皮细胞和补体的相互作用又可以介导NETs的形成和免疫血栓形成，从而形成凝血正反馈激活^[21]。研究^[22]表明，脓毒症患者血浆中的cfDNA含量与凝血酶形成的速率和程度呈正相关，cfDNA不但能够通过抑制组织纤溶酶原激活物来破坏纤溶系统，还能够招募循环中的红细胞，促进血管性血友病因子、纤维蛋白原和纤维蛋白沉积，促使血栓形成^[23]。H3可以直接诱导上皮和内皮细胞死亡^[24]，并可通过与TLR2、TLR4结合，激活下游ERK/AKT/p38通路，促使血小板聚集及微血栓形成。此外，NE的分泌会降解蛋白多糖并促进血小板粘附^[25]。

3.3 炎症反应和器官功能障碍

脓毒症发生时，NETs能够随中性粒细胞在机体任何部位形成释放，促进炎症反应和组织器官损伤^[26]。cfDNA过多生成引起微血管闭塞和组织缺氧从而导致多器官功能损伤^[27]，H3可以作为趋化因子，诱导炎症因子产生及白细胞和组织细胞凋亡，同时激发直接细胞毒性，引发炎症反应^[28–30]。Mikacenic等^[31]研究观察到在脓毒症患者呼吸系统有大量中性粒细胞浸润及NETs，并与急性呼吸窘迫综合征的发生有关。研究^[32]发现腹腔脓毒症患者NETs通过形成CXCL2、IL-6、HMGB1等促炎复合物介导组织损伤。研究^[33]将H3注射到小鼠肾动脉中诱导了急性肾损伤的发生，且检测到循环cfDNA浓度越高，小鼠的死亡率越高。研究^[34]通过体外和体内实验发现METTL3会通过NETs介导的m6A修饰及肺泡上皮细胞铁蛋白下垂，引起脓毒症患者和小鼠相关急性肺损伤(SI-ALI)。此外，研究还发现NETs还能够直接刺激巨噬细胞引起慢性炎症反应。

4 NETs潜在的治疗靶点

肽基精氨酸脱氨酶4(peptidylarginine deiminase 4, PAD4)所催化的H3瓜氨酸化参与NETosis染色质解聚^[36]，PAD4基因缺陷小鼠的NETs生成水平、脓毒症发生率和器官功能障碍严重程度均显著降低^[37]。PAD4抑制剂GSK484能减少小鼠中性粒细胞中的kindlin-3，进而降低NETs生成并抑制血栓形成^[38]；PAD4脱氨活性抑制剂(Cl-amidine)和BBCl脒均可抑制NETs生成，并减少血管损害和内皮功能障碍^[39]。

脱氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease, DNase)能够消化DNA的核酸内切酶，抑制NETs形成。DNase1和DNase1-Ⅲ可在体内独立表达，在脓毒症中降解NETs的DNA骨架，使用DNase治疗脓毒症小鼠，可改善小鼠肺损伤，降低病死率^[40]。

病原体激活血小板TLR4触发血栓、炎症和凝血反应，参与动物和人类NETs的生成及脓毒症的发生^[41]。TAK-242(Resatorvid)为TLR4小分子特异性抑制剂，通过阻断TLR4与衔接蛋白TIRAP和TRAM之间的相互作用，而减少炎症的发生；A2乙酰氨基吡喃苷化合物(MW 389)可以抑制脓毒症小鼠iNOS RNA和TNF-α的产生，提高存活率；此外，他汀类药物及血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂对TLR4均有着抑制作用。

功能性抗IL-8阻断剂mAb和IL-8受体拮抗剂reparixin可降低脓毒症患者血浆NETs生成，IL-5，IL-9，IL-12，IL-17等炎症因子与NETs的生成呈负相关^[2]。

5 总结与展望

NETs与脓毒症的发生发展密切相关，一方面，NETs可以在免疫防御中发挥清除病原体及限制炎症扩散的作用，另一方面，NETs的过度激活也会促发免疫反应，导致血栓形成、炎症反应失控及器官衰竭等不良后果。因此，NETs的探讨将为脓毒症治疗的干预靶点提供新的方向。