增强类淋巴引流减轻创伤后脑水肿

文献地址: 10.1038/s41586-023-06737-7.

1. 肾上腺素能抑制能够减轻TBI后脑水肿、促进功能恢复

       笔者团队首先评估了TBI小鼠模型中脑水肿，发现损伤后30 min，伤侧半球和对侧半球的脑含水量明显增加（图1a）。既往文献表明，TBI抑制类淋巴流动（定义为胶质细胞依赖性的经血管周围间隙的CSF流动）。由于肾上腺素能信号抑制类淋巴运输，为改善脑内液体运输，笔者团队抑制泛肾上腺素能受体。使用的鸡尾酒药物（以下简称PPA）包括哌唑嗪（α1-肾上腺素能受体拮抗剂）、阿替帕美唑（β2-肾上腺素能拮抗剂）和普萘洛尔（泛β-肾上腺素能受体阻断剂）。小鼠遭受TBI后，立即PPA腹腔注射，连续给药3天（图1b）。

       值得注意的是，PPA治疗几乎完全消除了TBI后脑水肿（图1a）。此外，PPA对TBI后急性脑水肿的抑制能够带来长期的行为学获益，表现为接受PPA治疗的小鼠神经功能评分（图1c–e）、转棒实验（图1f）和悬挂实验（图1g）均显著改善。水迷宫实验评估TBI小鼠的空间学习和记忆障碍。与TBI小鼠相比，PPA处理的TBI小鼠在创伤2周后的空间学习和记忆功能显著增强（图1h）。

图1. 肾上腺素能抑制能够减轻TBI后脑水肿、促进功能恢复

2. 类淋巴功能衰竭后脑水肿

       基于以上数据，笔者团队考虑TBI后脑水肿是否由于血管或CSF腔室的液体涌入增加，亦或是脑组织液流出受阻所致。研究人员首先证实TBI与CSF示踪剂转运急性受阻有关（图2a–d），PPA治疗部分挽救了CSF流入（图2b、c）。此外，图2d显示TBI后6个月的类淋巴功能持续受损。在体内透颅成像（图2b、c）和脑片分析（图2d）均表明，TBI导致持久性的类淋巴流动受阻。

3. CSF潴留是TBI后水肿的重要原因

       近期研究表明，CSF是卒中后脑水肿的主要贡献者。为分别评估血管渗出和CSF生成对TBI水肿的贡献，笔者团队在TBI后（<5 min）分别通过静脉或脑池注射放射性钠（²²Na）来标记这两个液体隔室（图2e，f）。在30 min后收集脑组织，并量化大脑半球中²²Na含量。当标记血液腔室后，伤侧半球中²²Na含量无显著差异（图2e）。当标记脑池腔室后，伤侧半球中22Na摄取显著减少，但PPA治疗显著增加了伤侧脑组织²²Na摄取（图2f）。与类淋巴功能分析结果一致，TBI抑制了CSF示踪剂的流入，而PPA治疗部分恢复了该过程（图2b-f）。

图2. 泛肾上腺素能抑制恢复脑外伤后类淋巴外流受抑。

4. PPA促进TBI后CSF外流

       目前，TBI对CSF生成的影响尚不确切。因此，笔者团队在TBI和对照小鼠中量化了前脑脑室中CSF的生成，发现TBI显著降低了脑室CSF的产生（至少90％），而PPA治疗能够部分挽救这种下降（图2g–i）。这似乎是个悖论？PPA治疗增加TBI后CSF流入和生成，却能有效减轻脑水肿。笔者团队假设PPA可能通过增强液体排出，防止水肿形成。为了验证这个想法，研究人员向小鼠颅内注射的一种近红外示踪剂DB53，并评估其清除情况。DB53在大脑中自由扩散，入血后与白蛋白紧密结合，并在几天内可被测量。因此，股静脉内的DB53水平与从脑中被清除的总DB53（通过类淋巴和淋巴清除）水平直接相关。结果显示，TBI后示踪剂流出减少，而PPA部分恢复了这一现象（图3a–c）。因此，PPA治疗通过提高DB53类淋巴清除，同时消除了创伤后脑水肿（图1a和图3c），表明肾上腺素通过抑制类淋巴清除在创伤后脑水肿中发挥重要作用。

5. TBI后类淋巴外流受损

       肾上腺素信号不仅是类淋巴功能的关键调节因子，同时也是外周淋巴系统活动的调控因子，包括颈淋巴管（CLVs）。低水平NA可增强淋巴管收缩频率，而过度或持续NA刺激则产生相反效果。笔者团队通过向脑脊液注射FITC-葡聚糖和Texas Red微球的混合物，并量化它们流向浅、深层颈淋巴结的情况，首次证实TBI后CLV引流受到抑制（图3d–f）。对示踪剂信号强度、淋巴结大小和示踪剂分布区域的详细分析证实这些发现（图3e,f）。通过高速双光子在体记录示踪微球（图3g,h），显示TBI后微球计数大大减少，但PPA部分恢复了微粒计数（图3h）。此外，PPA处理恢复了TBI导致的淋巴管直径缩小（图3i）、平均速度降低（图3j）。基于平均速度和管径得出淋巴管的流量速度，显示TBI后淋巴流速减少，但PPA恢复了淋巴流速（图3j）。此外，通过测量逆行流来量化瓣膜功能失调。在未受伤的对照小鼠中，逆行流平均为36.3±1.7%，TBI后增加至43.2±2.2%，PPA处理后仍保持在42.7±2.1%（图3j）。图3k显示，通过淋巴管内流体传输的数值模拟，获得了与实验测量非常接近的体积流速预测结果。

6. PPA降低TBI导致的NA激增

       接下来，笔者团队研究泛肾上腺素抑制如何发挥神经保护作用。首先测量TBI后血浆NA水平变化情况，发现TBI后血浆NA立即升高（图4a）。在收集的对侧半球微透析样本中发现，NA水平在TBI次达到峰值，其水平约为基线水平的5-8倍（图4a）。PPA在很大程度上消除了TBI引起的血浆和脑中NA水平激增（图4a）。因此，血浆和脑间质液中激增的NA似乎抑制了由脑膜和颈淋巴管将液体从CNS运输至血液循环的通路。由于肾上腺素能信号是淋巴流动的关键负调节因子，这些数据表明PPA可能促进类淋巴流动。

        然而，创伤后颈淋巴管的低容积转运引发以下问题：（1）脑内肾上腺素激增是否导致液体外流减少、滞留增多；（2）PPA是否能够抵消去甲肾上腺素激增，提高颈淋巴管的泵送效率；（3）在离体环境下，

淋巴管在不同浓度肾上腺素刺激后的反应。笔者团队通过一系列实验来解答这些问题。

7. PPA促进淋巴回流恢复正常

      笔者团队在暴露的颈浅淋巴管上局部应用不同浓度的NA，发现NA以剂量依赖的方式减少淋巴管的收缩频率和振幅，而PPA逆转了这种效应（图4b）。为研究NA的独立影响，笔者团队切除并导管化颈淋巴管，在体外条件恒定的内部压力（0.5-3 cm H2O）下进行了收缩参数的定量分析，发现给予NA破坏了淋巴管的收缩波同步（图4c），这对于克服压力梯度推进淋巴液流动至关重要。此外，NA导致较低的传导速度，较短的传导长度和多个起搏点，但都被PPA处理所抑制（图4d）。

8. PPA促进心血管参数正常化

       淋巴回流受到中心静脉压调控。因此，笔者团队评估了TBI后一些心血管参数的变化，发现TBI引起平均动脉压(MAP)和脑血流量(CBF)下降，颅内压（ICP）和中心静脉压（CVP）增加，但这些参数在PPA治疗后恢复到正常水平(图4e，f)。

9. 颈淋巴管输出神经碎片

在颈浅表淋巴管成像时，笔者团队检测到淋巴管存在黑色、不均匀大小的颗粒，并且在TBI+PPA组中最常见(图5a，b)。通过在皮层中星形胶质细胞和神经元中表达钙指示剂GCaMP7，鉴定这些颗粒为皮质碎片(图5c、d)。随后的组织（TBI后60-90 min收集的颈部淋巴结）分析显示，PPA处理后GCaMP7和BSA-647（CSF示踪剂）的信号强度显著增加(图5e-k)。

图5. TBI后颈淋巴管输出神经碎片